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如何大量buffer exchange ssDNA
[版面:生物学][首篇作者:thinkkkdo] , 2019年03月13日20:47:30 ,600次阅读,14次回复
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thinkkkdo
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发信人: thinkkkdo (Let it 不 go), 信区: Biology
标  题: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Mar 13 20:47:30 2019, 美东)

最近在研究如何大量buffer exchange ssDNA。

有一批ssDNA, 大概10mg/mL, 100mL的样子。分子量大概5kDa,里面有100mM DTT需要除
掉。请问有什么办法可以快速有效的buffer exchange除掉DTT,而不怎么稀释浓度和损
伤ssDNA分子。

试过ZeBa column, 一个最大的柱子一次最多也就能过大概2mL*10mg/mL=20mg。yield大
概是60%。我得用50个柱子才行。

在AKTAexplorer上试过GE Hitrap Q and Hitrap DEAE的阴离子交换柱. 1mL的柱子大概
只能结合15-20mg DNA.样品会被稀释到大概3-4mg/mL.

暂时想不到什么其他有效的办法。版上高人众多。有过类似经验的能否介绍一下经验?
多谢了。
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BIO2016
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发信人: BIO2016 (风之子), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Mar 13 20:52:14 2019, 美东)

乙醇沉淀?
【 在 thinkkkdo (Let it 不 go) 的大作中提到: 】
: 最近在研究如何大量buffer exchange ssDNA。
: 有一批ssDNA, 大概10mg/mL, 100mL的样子。分子量大概5kDa,里面有100mM DTT需要除
: 掉。请问有什么办法可以快速有效的buffer exchange除掉DTT,而不怎么稀释浓度和损
: 伤ssDNA分子。
: 试过ZeBa column, 一个最大的柱子一次最多也就能过大概2mL*10mg/mL=20mg。yield大
: 概是60%。我得用50个柱子才行。

: 在AKTAexplorer上试过GE Hitrap Q and Hitrap DEAE的阴离子交换柱. 1mL的柱子大概
: 只能结合15-20mg DNA.样品会被稀释到大概3-4mg/mL.
: 暂时想不到什么其他有效的办法。版上高人众多。有过类似经验的能否介绍一下经验?
: ...................



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Mahoning
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发信人: Mahoning (宝盖俄州), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Mar 13 21:24:28 2019, 美东)

dialysis?
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rutherford
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发信人: rutherford (jack), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Mar 13 22:11:58 2019, 美东)

用Amicon,买分子量cut off 3000那种,一管子15ml,一次离心就可以同时装6管还是8管
【 在 thinkkkdo (Let it 不 go) 的大作中提到: 】
: 最近在研究如何大量buffer exchange ssDNA。
: 有一批ssDNA, 大概10mg/mL, 100mL的样子。分子量大概5kDa,里面有100mM DTT需要除
: 掉。请问有什么办法可以快速有效的buffer exchange除掉DTT,而不怎么稀释浓度和损
: 伤ssDNA分子。
: 试过ZeBa column, 一个最大的柱子一次最多也就能过大概2mL*10mg/mL=20mg。yield大
: 概是60%。我得用50个柱子才行。
: 在AKTAexplorer上试过GE Hitrap Q and Hitrap DEAE的阴离子交换柱. 1mL的柱子大概
: 只能结合15-20mg DNA.样品会被稀释到大概3-4mg/mL.
: 暂时想不到什么其他有效的办法。版上高人众多。有过类似经验的能否介绍一下经验?
: 多谢了。
: ...................


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fronte
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发信人: fronte (fronte), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 14 04:19:24 2019, 美东)

超滤,G25柱脱盐,透析都可以

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thinkkkdo
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发信人: thinkkkdo (Let it 不 go), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 14 07:40:16 2019, 美东)

多谢楼上几位。

乙醇沉淀考虑过, 怕DTT和乙醇弄不干净,影响下一步的应用。

dialysis需要的时间比较长,可能需要overnight才能除干净。已经reduced的oligo可
能又被氧化了。不过可以考虑。

desalting受体积的影响,需要大量的柱子。或者请问有什么比较大的柱子能一次
desalting比较大的volume? 还是说需要自己pack柱子?

超滤的话有什么装置可以推荐的吗?

【 在 fronte (fronte) 的大作中提到: 】
: 超滤,G25柱脱盐,透析都可以



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goretex
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发信人: goretex (GORE-TEX), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 14 11:53:22 2019, 美东)

amicon 15
100 mL算个屁的大量啊,我点进来想回TFF的

【 在 thinkkkdo (Let it 不 go) 的大作中提到: 】
: 多谢楼上几位。
: 乙醇沉淀考虑过, 怕DTT和乙醇弄不干净,影响下一步的应用。
: dialysis需要的时间比较长,可能需要overnight才能除干净。已经reduced的oligo可
: 能又被氧化了。不过可以考虑。
: desalting受体积的影响,需要大量的柱子。或者请问有什么比较大的柱子能一次
: desalting比较大的volume? 还是说需要自己pack柱子?
: 超滤的话有什么装置可以推荐的吗?



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※ 修改:·goretex 於 Mar 14 11:53:39 2019 修改本文·[FROM: 2601:641:480:503]
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ArtyArty
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发信人: ArtyArty (Art Lover!), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 14 12:18:40 2019, 美东)

True, Amicon spin column is the best way if you don't want to do dialysis.

【 在 goretex (GORE-TEX) 的大作中提到: 】
: amicon 15
: 100 mL算个屁的大量啊,我点进来想回TFF的



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thinkkkdo
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发信人: thinkkkdo (Let it 不 go), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 14 22:41:20 2019, 美东)

Amicon还真不行。我能找到的最小的3KDa, 过滤5KDa的ssDNA,基本上都会漏掉。


【 在 goretex (GORE-TEX) 的大作中提到: 】
: amicon 15
: 100 mL算个屁的大量啊,我点进来想回TFF的



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Nexgen
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发信人: Nexgen (漂流), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 15 10:39:38 2019, 美东)

你是一次性的实验,还是要重复?cost不一样,方法会不同。

【 在 thinkkkdo (Let it 不 go) 的大作中提到: 】
: 最近在研究如何大量buffer exchange ssDNA。
: 有一批ssDNA, 大概10mg/mL, 100mL的样子。分子量大概5kDa,里面有100mM DTT需要除
: 掉。请问有什么办法可以快速有效的buffer exchange除掉DTT,而不怎么稀释浓度和损
: 伤ssDNA分子。
: 试过ZeBa column, 一个最大的柱子一次最多也就能过大概2mL*10mg/mL=20mg。yield大
: 概是60%。我得用50个柱子才行。

: 在AKTAexplorer上试过GE Hitrap Q and Hitrap DEAE的阴离子交换柱. 1mL的柱子大概
: 只能结合15-20mg DNA.样品会被稀释到大概3-4mg/mL.
: 暂时想不到什么其他有效的办法。版上高人众多。有过类似经验的能否介绍一下经验?
: ...................



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goretex
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发信人: goretex (GORE-TEX), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 15 18:59:44 2019, 美东)

那自己买1 kDa的UF membrane去TFF吧

【 在 thinkkkdo (Let it 不 go) 的大作中提到: 】
: Amicon还真不行。我能找到的最小的3KDa, 过滤5KDa的ssDNA,基本上都会漏掉。



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发信人: thinkkkdo (Let it 不 go), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 15 21:12:45 2019, 美东)

就一次性的实验。所以如果是disposable的东西最好。

【 在 Nexgen (漂流) 的大作中提到: 】
: 你是一次性的实验,还是要重复?cost不一样,方法会不同。



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发信人: thinkkkdo (Let it 不 go), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 15 21:18:43 2019, 美东)

UF还真没用过。请问如果我想买500Da cutoff, vol 50-200mL 的超滤膜,哪里能买到
, 有什么可以推荐的吗?

【 在 goretex (GORE-TEX) 的大作中提到: 】
: 那自己买1 kDa的UF membrane去TFF吧



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发信人: goretex (GORE-TEX), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Mar 16 03:16:17 2019, 美东)

Koch, 500 Da我不知道属于他们UF还是NF
也未必有现成的cartridge
【 在 thinkkkdo (Let it 不 go) 的大作中提到: 】
: UF还真没用过。请问如果我想买500Da cutoff, vol 50-200mL 的超滤膜,哪里能买到
: , 有什么可以推荐的吗?



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发信人: thinkkkdo (Let it 不 go), 信区: Biology
标  题: Re: 如何大量buffer exchange ssDNA
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Mar 17 20:20:08 2019, 美东)

anyway, Thanks a lot!

【 在 goretex (GORE-TEX) 的大作中提到: 】
: Koch, 500 Da我不知道属于他们UF还是NF
: 也未必有现成的cartridge



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